Cell Counting Kit-8（CCK-8）是WST-8在電子耦合試劑的作用下，可被細胞線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性甲臜染料。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺（生成的 formazan 量）和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。CCK-8 溶液可以直接加入到細胞樣品中，不需要預配各種成分，可廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測。該試劑盒無放射性。

操作說明

本試劑盒可以用于細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測。

1, 標準曲線制作

1)，先用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞；

2)，按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做 5-7 個細 胞濃度梯度，每組 2-3 個復孔；

3)，接種后培養(yǎng) 2-4 小時使細胞貼壁，然后每 100 μL 培養(yǎng)基加 10 μL CCK-8 試劑培養(yǎng)一定時間后測定 OD 值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標，OD 值為縱坐標的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量。 使用此標準曲線的前提條件是試驗條件完全一致。

2, 細胞活性檢測

1)，在 96 孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) ，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng) 24 小時；

2)，向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡) ；

3)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時；

4)，用酶標儀測定 450 nm 處的吸光度。

3,  細胞增殖-毒性檢測

1)，在 96 孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) ，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng) 24 小時；

2)，向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物；

3)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間；

4)，向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；

5)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時；

6)，用酶標儀測定 450 nm 處的吸光度。

4，計算公式

細胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As:  實驗孔吸光度 (含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液)；

Ac: 對照孔吸光度 (含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物)；

Ab: 空白孔吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物)。

保存條件

4°C避光保存，一年有效。

注意事項

1)， CCK-8 的培養(yǎng)時間一般為 1-4 小時，但在培養(yǎng) 30 分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度，根據(jù)細胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8 的最佳反應時間以具體顯色的最佳時間為準。

2)， 接種時注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下 來，導致每孔中的細胞數(shù)量不等，可以每接種幾個孔就混勻一下。培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)基容易揮發(fā)，為了減少誤差，建議培養(yǎng)板的四邊每孔只加培養(yǎng)基，而不作為指標檢測孔。

3)，本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，所以還原劑 （如一些抗氧化劑） 會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。 用酶標儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定。

4)，培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計算時通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

5)，CCK-8 試劑對細胞的毒性非常低。它和活細胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應使溶液顏色不斷加深，OD 值不斷增加 （注: 活細胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的）。

6)，以下方法可以終止 CCK-8 反應（96 孔板） ：

(a). 在顯色反應后，將培養(yǎng)板放置 4 °C 冰箱內(nèi)。

(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl 溶液。

(c). 每孔加 10 μL 1 % （w/v） 的 SDS （十二烷基硫酸鈉）溶液。

注意：反應停止后，應在 24 小時內(nèi)測定。

7)，本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

8)，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。